加药时间:由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。随着细胞的代谢G418的浓度和活性都回下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。这时药物浓度可以降至200ug/ml。培养液:加药筛选约6天左右，细胞会大量死亡，孔中只剩下的细胞。这时会出现两个问题：1.死亡的细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有neo表达的阳性细胞死亡，即非选择性死亡。2.孔中细胞数目很少，细胞之间的信号会变得很弱，也会导致阳性细胞的状态不佳甚至死亡。这个时候需要一种特殊的培养液：假如你要转染3T3细胞，在3T3细胞汇合度达到80%的时候，换液，培养过夜之后收集培养液，通过滤器消毒，和新鲜的培养液按1：1混合备用。再转染后筛选过程中就可以应用这种培养基。BMC原代分离步骤：加5倍以上体积的PBS洗2次，每次离心1500rpm，10min。磷酸缓冲盐溶液(10×PBS,无钙镁,RNase free)
弱酸-弱碱型缓冲溶液（即共轭酸碱缓冲溶液）、酸式盐缓冲溶液、强酸或强碱溶液。在一些特殊情况下也使用混合体系的缓冲溶液（两种pKa相近的共轭酸碱缓冲溶液混合而成）。大家比较熟悉的是共轭酸碱缓冲溶液，例如，HAc-NaAc、HF-NH4F、NH3-NH4Cl。其实，酸式盐也可作为缓冲溶液，因为酸式盐的pH值大多是恒定的，随其浓度增减的变化不大，例如，NaHCO3溶液在1.0M至0.01M之间，其pH值几乎都在8左右（理论值为8.3），同样可以抵抗溶液中产生的少量强酸、强碱（或外加），保持溶液的pH值恒定或变化微小。强酸、强碱溶液也能缓冲滴定过程中产生的少量强酸或强碱，保持溶液的pH值变化很小，故强酸强碱也可作为广义的pH缓冲溶液（以前的分析化学教材就是这样分的），例如，EDTA络合滴定铋，需另外加入一定量的0.1mol/L硝酸溶液，就是为了增强溶液对滴定中产生的H+的缓冲作用。磷酸缓冲盐溶液(10×PBS,无钙镁,RNase free)丁胺卡那霉素给药说明：不可直接静脉推注，以免产生神经肌肉阻滞和呼吸克制作用。
pH缓冲溶液的类型与作用：pH缓冲溶液包括两大类：标准缓冲溶液和普通缓冲溶液。标准缓冲溶液主要用在酸度计测量溶液pH值时的仪器校正和定位，要求数值准确、精确。因此对试剂纯度、浓度准确性、温度等都有严格要求，这类缓冲溶液有专门的化学试剂商品，可以购买配制，也可以用优级纯试剂按资料的配比配制。普通缓冲溶液主要用于化学分析和仪器分析中要控制一定pH值的测定过程中。几乎所有的EDTA络合滴定都必须在一定的pH范围内进行，因此，需要加入pH缓冲溶液，例如，测定铅、锌用到HAc缓冲溶液，测定钙、镁、锌用到氨缓冲溶液。又如，氧化还原滴定中，碘量法测铜要用到NH4HF2，碘量法测砷、锑要加NaHCO3。
Tricine加样缓冲液(2×)使用说明书 说明书：①试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。②实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。③使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。④加入试剂的顺序，以保证所有反应板孔温育的时间一样。⑤按说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。Tricine加样缓冲液(2×)：产品规格：5ml。分类：电泳蛋白。储存条件：—20℃,12个月。用途：又称三羟甲基甘氨酸加样缓冲液,Tris-tricine缓冲系统的PAGE电泳。注意事项：主要由Tris-HCl、DTT、G-250等组成。注意事项：为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
注意事项：1.全过程样本、试剂及实验环境均需在 20±2℃的条件下进行。为获得较佳的实验结果，较好在取样 2h内进行实验，样品存放时间越长，细胞分离效果越差。样品放置超过 6h后分离效果更差甚至不能达到分离目的。2.本实验较好不要使用高聚合材质（如聚苯乙烯）的塑料制品，应使用无静电、低静电离 心管及未经碱处理过后的玻璃制品，因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面 会变成毛面，影响细胞分离效果。3.吸取过多的淋巴细胞层及分离液层会导致分离液交界处的粒细胞被吸出从而使混杂的粒 细胞数量增加。4.分离液用量大于组织单细胞悬液样本时，分离效果更佳。室温条件，水平转子离心400g，离心30-40min，可见细胞分层。磷酸缓冲盐溶液(10×PBS,无钙镁,RNase free)
一般植物细胞筛选浓度在 20～200μ g/ml，动物细胞筛选浓度 50～1000μ g/ml。磷酸缓冲盐溶液(10×PBS,无钙镁,RNase free)
溶故配制注意事项：1.药品要有较好的质皿试剂分为优级纯（保证试剂，Guaranteed reagent,G.R.)，分析试剂(Antalytical reagent, A. R.)化学纯(Chemical pure，C. P.)和实验试剂(Laboratory reagent, L. R.)等等。化学试剂，杂质较多。只在个别情况下应用。如配洗液用的硫酸、配干燥剂的氯化钙等。2.药品称且要精确。3.配制试剂用水应用新鲜的去离子水或双蒸馏水，比电闭值在50万欧姆以上，PH在5.5-7.0之间才可应用，在组织培养等特殊用途时应注意此顶要求。配制一般化9k用溶液只要求用双燕蒸馏水或去离子水.4.配好后的溶液，应立即除菌处理(如高压灭菌、抽滤或加抑菌物质),以防杂菌生长。磷酸缓冲盐溶液(10×PBS,无钙镁,RNase free)
