新一代微型化双光子荧光显微镜体积小,重只2.2克,适于佩戴在小动物头部颅窗上,实时记录数十个神经元、上千个神经突触的动态信号。在大型动物上,还可望实现多探头佩戴、多颅窗不同脑区的长时程观测。相比单光子激发,双光子激发具有良好的光学断层、更深的生物组织穿透等优势,其横向分辨率达到0.65μm,成像质量与商品化大型台式双光子荧光显微镜可相媲美,远优于目前领域内主导的、美国脑科学计划重要团队所研发的微型化宽场显微镜。采用双轴对称高速微机电系统转镜扫描技术,成像帧频已达40Hz(256*256像素),同时具备多区域随机扫描和每秒1万线的线扫描能力。此外,采用自主设计可传导920nm飞秒激光的光子晶体光纤,该系统实现了微型双光子显微镜对脑科学领域较广泛应用的指示神经元活动的荧光探针(如GCaMP6)的有效利用。 同时采用柔性光纤束进行荧光信号的接收,解决了动物的活动和行为由于荧光传输光缆拖拽而受到干扰的难题。未来,与光遗传学技术的结合,可望在结构与功能成像的同时,精细地操控神经元和神经回路的活动。双光子显微镜的原理是什么?进口布鲁克双光子显微镜授权公司
许多生物医学成像方式,无论是单光子(共聚焦)或多光子(双光子),都使用激光作为光源,并需要兼容的荧光染料。荧光染料有自己的激发波长,它们可以被单个光子以该激发波长的光子能量激发(E=hv=h*c/λ);或者是两个几乎同时到达的光子,但每个光子的能量约为单光子能量的一半,即双波长(0.5E->2λ)。前者是单光子显微镜原理,后者是双光子显微镜原理。在对同一种荧光染料进行成像时,双光子与单光子相比可以使用约两倍波长,因此双光子的散射较小(波长较长,散射较小),可以更深入地渗透到组织中。美国ultima2PPLUS双光子显微镜应用双光子显微镜可以进行厚的组织样品拍摄。
激光共聚扫描显微镜脱离了传统光学显微镜的场光源和局部平面成像模式,采用激光束作光源,激光束经照明,经由分光镜反射至物镜,并聚焦于样品上,对标本焦平面上每一点进行扫描。组织样品中的荧光物质受到刺激后发出的荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜,通过探测时先聚焦,然后被光探头收集,转化为信号输送到计算机进行处理。这个装置能让通过探测的只有焦平面上发出的荧光,使成像更为清晰准确,同时通过改变物镜的焦距,能对不同焦平面进行扫描,通过计算机绘出普通显微镜无法观测的三维图像。而配合了双光子激发技术,激光共聚扫描显微镜则能更好得发挥功效。那么,什么是双光子激发技术呢?在高光子密度的情况下,荧光分子可以同时吸收2个长波长的光子使电子跃迁到较高能级,经过一个很短的时间后,电子再跃迁回低能级同时放出一个波长为长波长一半的光子(P=h/λ)。利用这个原理,便诞生了双光子激发技术。
像差问题一直困扰着光学领域的工作者。像差会使光波前发生形变,不仅降低成像的信噪比和分辨率,使得很多时候我们只能“雾里看花”,更甚者,产生赝像,或无法获得有意义的图像。像差问题对双光子成像的影响尤为严重,因为在那里,荧光信号对入射光强度的依赖是平方关系,一旦入射光波前形变,不仅聚焦强度大幅下降,成像分辨率也急剧恶化。因此,如何解决像差问题,实现,例如小鼠大脑皮层,深层区域的高质量成像成为光学成像发展中相当有挑战性的问题之一。双光子显微镜能够进行光裂解、光转染和光损伤等光学操纵。
利用钙成像技术记录大脑活动,随着功能光学成像技术的发展,神经学家们已经可以研究脑区和神经元内部的工作情况。功能钙成像技术就是其中之一,其主要原理是将外源性荧光信号和生理现象耦合起来——通过荧光染料信号的改变反映细胞内游离钙离子浓度,以此细胞的功能状态。目前它被广泛应用于实时监测一群相关神经元内钙离子的变化,从而判断其功能活动。该技术的出现使得科学家可以亲眼目睹神经信号在神经网络之中时间和空间上的传递穿梭。双光子显微镜将得到更大的发展与更广的应用。国内bruker双光子显微镜成像视野
双光子显微镜使用长波长脉冲光,是通过物镜汇聚的。进口布鲁克双光子显微镜授权公司
实验从理论和实验上评估了多焦点v2PE显微镜的空间分辨率,并与单光子荧光显微镜进行了对比,实验中v2PE的激发波长为521 nm,使用放大倍率为100倍的物镜,尺寸为0.6AU,对直径100nm的荧光颗粒进行了测试性成像,共获得40幅不同采样深度的图像合成为三维图像。图像在横向和纵向的半高全宽分别是177 nm和297 nm,这些值接近显微镜的理论分辨率。后续还利用软件模拟从理论上研究了多焦点v2PE显微技术的空间分辨率,模拟计算显示v2PE点扩散函数(PSF)的横向半高宽与单光子激发荧光(1PE)相似,轴向的半高宽较1PE减少,可以提高空间分辨率。进口布鲁克双光子显微镜授权公司