和很多伟大的科学发明一样，双光子显微镜的出现也有一点偶然，但正是那瞬间的灵感为生物科学尤其是神经科学带来了一种**性的成像技术：双光子激发荧光显微镜。1990年初，当WinfriedDenk刚从康奈尔大学博士毕业准备前往瑞士读博后时，他看了一本关于激光扫描显微镜的书，从中了解到非线性光学效应——强光和物质的相互作用。当时，Denk有同事研究生物样品中的钙离子但苦于没有强大的紫外激光器和光学元件，于是他就想到如果使用双光子吸收就能够绕开紫外，换言之，与其通过一个紫外光子激发标记的钙离子，通过两个双倍波长的可见光光子也能激发相同的荧光。有了想法后马上实验。借了一套染料飞秒激光器，Denk联合他的导师WattWebb及其博士生JamesStrickler只用六个小时就完成了实验搭建，采集数据则用了两到三天，于是一篇里程碑式的文章就此诞生了。双光子显微镜还可以对一些具有特性的染料细胞进行实验，还有一些短波长可以利用双光子特性进行特定实验。国内布鲁克双光子显微镜厂家电话
细胞内钙离子作为重要的信号分子其作用具有时间性和空间性。当个细胞兴奋时，产生了一个电冲动，此时，细胞外的钙离子流入该细胞内，促使该细胞分泌神经递质，神经递质与相邻的下一级神经细胞膜上的蛋白分子结合，促使这一级神经细胞产生新的电冲动。以此类推，神经信号便一级一级地传递下去，从而构成复杂的信号体系，终形成学习、记忆等大脑的高级功能。在哺乳动物神经系统中，钙离子同样扮演着重要的信号分子的角色。静息状态下大部分神经元细胞内钙离子浓度约为50-100nM，而细胞兴奋时钙离子浓度能瞬间上升10-100倍，增加的钙离子对于突触囊泡胞吐释放神经递质的过程必不可少。众所周知，只有游离钙才具有生物学活性，而细胞质内钙离子浓度由钙离子的内外流平衡所决定，同时也受钙结合蛋白的影响。细胞外钙离子内流的方式有很多种，其中包括电压门控钙离子通道、离子型谷氨酰胺受体、烟碱型胆碱能受体（nAChR）和瞬时受体电位C型通道（TRPC）等。神经元钙成像的原理就是利用特殊的荧光染料或钙离子指示剂将神经元中钙离子浓度的变化通过荧光强度表现出来，以反映神经元活性。该方法可以同时观察多个功能或位置相关的脑细胞。进口ultima双光子显微镜分辨率优势来源于其双光子光源的非线性光学效应。
实验从理论和实验上评估了多焦点v2PE显微镜的空间分辨率，并与单光子荧光显微镜进行了对比，实验中v2PE的激发波长为521 nm，使用放大倍率为100倍的物镜，尺寸为0.6AU，对直径100nm的荧光颗粒进行了测试性成像，共获得40幅不同采样深度的图像合成为三维图像。图像在横向和纵向的半高全宽分别是177 nm和297 nm，这些值接近显微镜的理论分辨率。后续还利用软件模拟从理论上研究了多焦点v2PE显微技术的空间分辨率，模拟计算显示v2PE点扩散函数(PSF)的横向半高宽与单光子激发荧光(1PE)相似，轴向的半高宽较1PE减少，可以提高空间分辨率。
双光子显微成像技术不是什么新技术，早在20多年前就有了，目前已经在生命科学和材料科学中广泛应用。几年前双光子**过期后，已经推出自己的双光子显微镜的厂家估计不少于10家以上。即便如此，世界上很多实验室都搭双光子，自己搭的好处有很多，首先是便宜，尤其是实验室已经有飞秒激光器，那就更很省钱了。其次是灵活，可以选择针对特殊用途的搭配，改动也灵活。结束后的好处就是可以锻炼队伍，一趟走下来可以把新手带出来，后期维护也更加自由。当然坏处也不少，首先是操心，特别是第1次搭的时候，开始要想方案，后来要解决各种实际问题。其次是花时间，加上买配件的时间，比买一台现成的商业化双光子耗时长。现在已经有不少关于如何搭双光子显微镜的文章，各种protocol，大多是老外写的，中文的较少。其实完全自己搭一套好用的系统还是不容易的，尤其是没有经验的时候，容易走弯路，多花钱，也多花时间，再加上双光子的重要器件都需要从国外购买，在国内买这些东西耗时较长。因此，我想总结一下我们的经验，贴出来分享，希望能帮到想自己动手的实验室双光子显微镜的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收 2 个长波长的光子。
2020年12月22日，临研所、病理科和科研处邀请北京大学王爱民副教授做了题目为“新一代微型双光子显微成像系统介绍及其在临床医疗诊断”的学术报告。学术报告由临研所医学实验研究平台潘琳老师主持。王爱民，北京大学信息科学技术学院副教授，毕业于北京大学物理系，获学士、硕士学位，后于英国巴斯大学物理系获博士学位。该研究组研发的微型双光子显微镜，第1次在国际上获得了小鼠大脑神经元和神经突触清晰稳定的动态信号，该成果获得了2017年度“中国光学进展”和“中国科学进展”，并被NatureMethods评为2018年度“年度方法--无限制行为动物成像”。目前，该研究组正在研究新一代双光子显微成像技术在临床诊断中的应用，为未来即时病理、离体组织检测、术中诊断等提供新的影像手段和分析方法。双光子显微镜的应用中，该如何选择以及更好的使用PMT。国内investigator双光子显微镜光毒性
双光子显微镜还可以对一些具有双光子特性的染料细胞进行特定实验；国内布鲁克双光子显微镜厂家电话
新一代微型化双光子荧光显微镜体积小，重只2.2克，适于佩戴在小动物头部颅窗上，实时记录数十个神经元、上千个神经突触的动态信号。在大型动物上，还可望实现多探头佩戴、多颅窗不同脑区的长时程观测。相比单光子激发，双光子激发具有良好的光学断层、更深的生物组织穿透等优势，其横向分辨率达到0.65μm，成像质量与商品化大型台式双光子荧光显微镜可相媲美，远优于目前领域内主导的、美国脑科学计划重要团队所研发的微型化宽场显微镜。采用双轴对称高速微机电系统转镜扫描技术，成像帧频已达40Hz（256*256像素），同时具备多区域随机扫描和每秒1万线的线扫描能力。此外，采用自主设计可传导920nm飞秒激光的光子晶体光纤，该系统实现了微型双光子显微镜对脑科学领域较广泛应用的指示神经元活动的荧光探针（如GCaMP6）的有效利用。 同时采用柔性光纤束进行荧光信号的接收，解决了动物的活动和行为由于荧光传输光缆拖拽而受到干扰的难题。未来，与光遗传学技术的结合，可望在结构与功能成像的同时，精细地操控神经元和神经回路的活动。国内布鲁克双光子显微镜厂家电话
