使用MPM对神经元进行成像时,通过随机访问扫描—即激光束在整个视场上的任意选定点上进行快速扫描—可以只扫描感兴趣的神经元,这样不仅避免扫描到任何未标记的神经纤维,还可以优化激光束的扫描时间。随机访问扫描可以通过声光偏转器(AOD)来实现,其原理是将具有一个射频信号的压电传感器粘在合适的晶体上,所产生的声波引起周期性的折射率光栅,激光束通过光栅时发生衍射。通过射频电信号调控声波的强度和频率从而可以改变衍射光的强度和方向,这样使用1个AOD就可以实现一维横向的任意点扫描,利用1对AOD,结合其他轴向扫描技术可实现3D的随机访问扫描。但是该技术对样本的运动很敏感,易出现运动伪影。目前,快速光栅扫描即在FOV中进行逐行扫描,由于利用算法可以轻松解决运动伪影而被普遍的使用。全球多光子显微镜主要生产地区分析,包括产量、产值份额等。美国共聚焦多光子显微镜系统
与传统的单光子宽场荧光显微镜相比,多光子显微镜(MPM)具有光学切片和深度成像的功能,极大地促进了研究人员对整个大脑深部神经的认识。2019年,JeromeLecoq等从脑深部神经元成像、大数量神经元成像、高速神经元成像三个方面讨论了相关的MPM技术。为了将神经元活动与复杂行为联系起来,通常需要对大脑皮层深处的神经元进行成像,这就要求MPM具备深度成像的能力。激发光和发射光会被生物组织高度散射和吸收,这是限制MPM成像深度的主要因素。虽然增加激光强度可以解决散射问题,但会带来其他问题,如烧焦样品、散焦和近表面荧光激发。增加MPM成像深度的比较好方法是使用更长的波长作为激发光。另外,对于双光子(2P)成像而言,离焦和近表面荧光激发是两个比较大的深度限制因素,而对于三光子(3P)成像这两个问题大大减小,但是三光子成像由于荧光团的吸收截面比2P要小得多,所以需要更高数量级的脉冲能量才能获得与2P激发的相同强度的荧光信号。 美国啮齿类多光子显微镜准确定位中国市场多光子显微镜进出口贸易趋势。
世界多光子激光扫描显微镜产业主要布局在德国和日本,德国是以徕卡显微系统和蔡司为,而日本以尼康和奥林巴斯公司为,2020年,上述企业占据着世界多光子激光扫描显微镜市场 64.44%的市场份额,其发展战略左右着多光子激光扫描显微镜市场的走向。目前世界市场对多光子激光扫描显微镜的需求在增长,中国市场这方面的需求增长更快,未来五年多光子激光扫描显微镜市场的发展在中国将具有很大的发展潜力。国内显微镜制造市场目前断层严重。目前我国显微镜行业发展缺乏技术沉淀,20 年以上经营积累的企业十分稀缺,深度精密制造、光学重要部件设计及工艺严重制约产业升级。目前中国显微镜中如多光子显微镜、共聚焦扫描和电子显微镜等主要集中在徕卡显微系统、蔡司、尼康、奥林巴斯等国外企业。国内具备生产显微镜能力的企业屈指可数,若国内显微镜企业能打破技术壁垒,切入显微镜市场,企业的生产经营将腾跃至一个更高的格局。
多光子显微优点:☆光损伤小:由于双光子显微镜使用的是可见光或近红外光作为激发光源,这一波段的光对细胞和组织的光损伤小,适用于长时间的研究;☆穿透能力强:相对于紫外光,可见光和近红外光都具有更强的穿透能力,因而受生物组织散射的影响更小,解决对生物组织中深层物质的层析成像研究问题;☆高分辨率:由于双光子吸收截面很小,只有在焦平面很小的区域内可以激发出荧光,双光子吸收*局限于焦点处的体积约为波长3次方的范围内;☆漂白区域小:由于激发只存在于交点处,所以焦点以外的区域都不会发生光漂白现象;☆荧光收集率高:与共聚焦成像相比,双光子成像不需要光学滤波器,这样就提高了对荧光的收集率,而收集率的提高直接导致图像对比度的提高;☆图像对比度高:由于荧光波长小于入射波长,因而瑞利散射产生的背景噪声只有单光子激发时的1/16,降低了散射的干扰;☆光子跃迁具有很强的选择激发性,所以可以对生物组织中一些特殊物质进行成像研究;☆避免组织自发荧光的干扰,获得较强的样品荧光:生物组织中的自发荧光物质的激发波长一般在350~560nm范围内,采用近红外或红外波段的激光作为光源,能**降低生物组织对激发光吸收。 世界多光子激光扫描显微镜产业主要布局在德国和日本,德国是徕卡显微系统和蔡司。
与传统的单光子宽视野荧光显微镜相比,多光子显微镜(MPM)具有光学切片和深层成像等功能,这两个优势极大地促进了研究者们对于完整大脑深处神经的了解与认识。2019年,JeromeLecoq等人从大脑深处的神经元成像、大量神经元成像、高速神经元成像这三个方面论述了相关的MPM技术[1]。想要将神经元活动与复杂行为联系起来,通常需要对大脑皮质深层的神经元进行成像,这就要求MPM具有深层成像的能力。激发和发射光会被生物组织高度散射和吸收是限制MPM成像深度的主要因素,虽然可以通过增加激光强度来解决散射问题,但这会带来其他问题,例如烧坏样品、离焦和近表面荧光激发。增加MPM成像深度比较好的方法是用更长的波长作为激发光。多光子激光扫描显微镜是建立在激光扫描显微镜技术基础上的实验方法,三维观察上提供更的光学切片能力。美国共聚焦多光子显微镜系统
1990年A.Mayer在Science上刊文展示了双光子激光扫描荧光显微镜。美国共聚焦多光子显微镜系统
快速光栅扫描有多种实现方式,使用振镜进行快速2D扫描,将振镜和可调电动透镜结合在一起进行快速3D扫描,但可调电动透镜由于机械惯性的限制在轴向无法快速进行焦点切换,影响成像速度,现可使用空间光调制器(SLM)代替。远程聚焦也是一种实现3D成像的手段,如图2所示。在LSU模块中,扫描振镜进行横向扫描,ASU模块包括物镜L1和反射镜M,通过调控M的位置实现轴向扫描。该技术不仅可以校正主物镜L2引入的光学像差,还可以进行快速的轴向扫描。想要获得更多神经元成像,可以通过调整显微镜的物镜设计来扩大FOV,但是具有大NA和大FOV的物镜通常重量较大,无法快速移动以进行快速轴向扫描,因此大型FOV系统依赖于远程聚焦、SLM和可调电动透镜。美国共聚焦多光子显微镜系统