1,光源、光路高度整合通过精密的设计,将飞秒激光器、扫描振镜、PMT、滤光片组,甚至是单光子荧光光路全套整合在一个不大的扫描头(ScanHead)内,无论扫描头如何移动,扫描头内的光路都可以保持稳定不变,从而实现了超稳定、免维护的特点。2,配合多维度、高精度机械控制系统。扫描头直接架设在一个多维运动的机械装置上,可沿任意方向和角度移动扫描头,方便对动物样本进行多方位的扫描观察。而这在常规方案的多光子显微镜上有很大的实现难度,不但需要多个关节组合的光路导向机构,并且在这些关节旋转的时候,都冒着极大的光路偏移的风险,以至于在使用一段时间后都需要对光路进行再次校准,而这样的问题在我司上则完全不会发生。3.一机多能。 中国市场多光子显微镜进出口贸易趋势。美国进口多光子显微镜飞秒激光
2020年,JianglaiWu等人提出提高2PM横向扫描速率的装置,称为FACED(free-spaceangular-chirp-enhanceddelay)。圆柱透镜将激光束一维聚焦,会聚角为Δθ。光束进入到一对几乎平行的高反射镜中,其间距为S,偏角为α。经过反射镜多次反射后,激光脉冲被分成多个传播方向不同的子脉冲(N=Δθ/α),脉冲间以2S/c的时间延迟(c,光速)回射。FACED模块输出处的子脉冲序列可以看作从虚拟光源阵列发出的光,这些子脉冲在中继到显微镜物镜后形成了一个空间上分离且时间延迟的焦点阵列。然后将该模块并入具有高速数据采集系统的标准双光子荧光显微镜中。光源是具有1MHz重复频率的920nm的激光器,通过FACED模块可产生80个脉冲焦点,其脉冲时间间隔为2ns。这些焦点是虚拟源的图像,虚拟源越远,物镜处的光束尺寸越大,焦点越小。光束沿y轴比x轴能更好地充满物镜,从而导致x轴的横向分辨率为0.82µm,y轴的横向分辨率为0.35µm。美国共聚焦多光子显微镜配置多光子显微镜是衡量一个国家制造业和高科技发展水平的重要标准之一。
多束扫描技术可以同时对神经元组织的不同位置进行成像该技术:对两个远距离(相距大于1-2 mm)的成像部位,通常使用两条单独的路径进行成像;对于相邻区域,通常使用单个物镜的多光束进行成像。多光束扫描技术必须特别注意激发光束之间的串扰问题,这个问题可以通过事后光源分离方法或时空复用方法来解决。事后光源分离方法指的是用算法来分离光束消除串扰;时空复用方法指的是同时使用多个激发光束,每个光束的脉冲在时间上延迟,这样就可以暂时分离被不同光束激发的单个荧光信号。引入越多路光束就可以对越多的神经元进行成像,但是多路光束会导致荧光衰减时间的重叠增加,从而限制了区分信号源的能力;并且多路复用对电子设备的工作速率有很高的要求;大量的光束也需要更高的激光功率来维持近似单光束的信噪比,这会容易导致组织损伤。
快速光栅扫描有多种实现方式,使用振镜进行快速2D扫描,将振镜和可调电动透镜结合在一起进行快速3D扫描,但可调电动透镜由于机械惯性的限制在轴向无法快速进行焦点切换,影响成像速度,现可使用空间光调制器(SLM)代替。远程聚焦也是一种实现3D成像的手段,如图2所示。在LSU模块中,扫描振镜进行横向扫描,ASU模块包括物镜L1和反射镜M,通过调控M的位置实现轴向扫描。该技术不仅可以校正主物镜L2引入的光学像差,还可以进行快速的轴向扫描。想要获得更多神经元成像,可以通过调整显微镜的物镜设计来扩大FOV,但是具有大NA和大FOV的物镜通常重量较大,无法快速移动以进行快速轴向扫描,因此大型FOV系统依赖于远程聚焦、SLM和可调电动透镜。多光子显微镜的发展现状及未来发展趋势。
多光子激发的特点。激发波长∶两个或多个光子同时激发,激发波长是单光子激发波长的两倍或多倍(i.e.红光能激发UV探针)。多光子激发∶依赖于多个光子同时到达的时间。使用脉冲飞秒激光器(i.e.10-16 seconds),且能提供更高的峰值功率。荧光限制在焦点处,能满足多个光子同时达到产生多光子吸收。荧光强度正比于(激光强度)n。为什么使用飞秒激光器?多光子激发需要超快的激光器,皮秒脉冲不能实现三光子激发。深度成像需要更高、更窄脉冲输出功率。多光子激发光源处于近红外区,对细胞毒性和光漂白更小。多光子显微镜适用于动物大脑皮层深层(400微米)细胞的形态、生理学研究。美国激光扫描多光子显微镜长时间观察
多光子显微镜在临床前评价IA形态、细胞外基质、细胞密度和血管形成等方面显示出强大的作用。美国进口多光子显微镜飞秒激光
光学成像技术与分子生物学技术的结合为研究上述科学问题提供了条件与可能。因此,在现代分子生物学技术基础上,急需发展新的成像技术。在动物体内,如何实现基因表达及蛋白质之间相五作用的实时在体成像监测是当前迫切需要解决的重大科学技术问题。这是也生物学、信息科学(光学)和基础临床医学等学科共同感兴趣的重大问题。对这-一一科学问题的研究不仅有助于阐明生命活动的基本规律、认识疾病的发展规律,而且对创新药物研究、药物疗效评价以及发展疾病早期诊断技术等产生重大影响。美国进口多光子显微镜飞秒激光