对单细胞形态与功能关系的研究,将膜片钳技术与单细胞逆转录多聚酶链是反应技术结合,在全细胞膜片钳记录下,将单细胞内容物或整个细胞(包括细胞膜)吸入电极中,将细胞内存在的各种mRNA全部快速逆转录成cDNA,再经常规PCR扩增及待检的特异mRNA的检测,借此可对形态相似而电活动不同的结果做出分子水平的解释或为单细胞逆转录多聚酶链式反应提供标本,为同一结构中形态非常相似但功能不同的事实提供分子水平的解释。目前国际上掌握此技术的实验室较少,我国北京大学神经科学研究所于1994年在国内率先开展。膜片钳技术是用玻璃微电极吸管把只含1-3个离子通道、面积为几个平方微米的细胞膜通过负压吸引封接起来。进口多通道膜片钳价格
一、记录设备首先,尽可能完善膜片钳记录设备是实验前的重要步骤,如用模型细胞测定电子设备、安装并测试应用软件、调节光学显微镜、检验防震工作台等。二、微电极的制备膜片钳电极是用外径为1-2mm的毛细玻璃管拉制成的。标准的毛细玻璃管(外经1.5mm,管壁厚0.3mm)适合于制作单通道记录的微电极,而全细胞记录则应选管壁较薄(0.16mm)的毛细玻璃管,这样可以使电极阻抗较低。三、封接(Sealing)技术封接(seal)是膜片钳记录的关键步骤之一。封接不好噪声太大必然影响细胞膜电信号的记录,一般要求封接阻抗至少20GΩ才可进行常规记录。为了形成良好封接必须保持清洁的溶液、良好的视野以及适当的电极镀膜。为了获得较好的"千兆欧封接",细胞表面必须裸露以便微电极前列能接触细胞,细胞的大小也是成功记录的个因素,一般选择10-20um的细胞比较理想。进口多通道膜片钳价格这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的或多个的离子通道分子活动的技术。
膜片钳放大器是整个实验系统中的主要,它可用来作单通道或全细胞记录,其工作模式可以是电压钳,也可以是电流钳。从原理来说,膜片钳放大器的探头电路即I-V变换器有两种基本结构形式,即电阻反馈式和电容反馈式,前者是一种典型的结构,后者因用反馈电容取代了反馈电阻,降低了噪声,所以特别适合较低噪声的单通道记录。由于供膜片钳实验的专门的计算机硬件及相应的软件程序的相继出现,使得膜片钳实验操作简便、效率提高。如与EPC-9型膜片钳放大器(内含ITC-16数据采集/接口卡)配套使用的软件PULSE/PULSEFIT,它既可产生刺激波形,控制数据采集,又可分析数据,同时具有用于膜电容监测的锁相放大器,多种软件功能集成于一体。
膜片钳技术原理:膜片钳技术是用玻璃微电极吸管把只含1-3个离子通道、面积为几个平方微米的细胞膜通过负压吸引封接起来(见右图),由于电极前列与细胞膜的高阻封接,在电极前列笼罩下的那片膜事实上与膜的其他部分从电学上隔离,因此,此片膜内开放所产生的电流流进玻璃吸管,用一个极为敏感的电流监视器(膜片钳放大器)测量此电流强度,就单一离子通道电流膜片钳技术的建立,对生物学科学特别是神经科学是一资有重大意义的变革。这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的(或多个的离子通道分子活动的技术。些技术的出现自然将细胞水平和分子水平的生理学研究联系在一起,同时又将神经科学的不同分野必然地融汇在一起,改变了既往各个分野互不联系、互不渗透,阻碍人们较全认识能力的弊端。这一技术的发现和基因克隆技术并架齐驱,给生命科学研究带来了巨大的前进动力。微电极的制备膜片钳电极是用外径为1-2mm的毛细玻璃管拉制成的。
全细胞记录构型(whole-cell recording) 高阻封接形成后,继续以负压抽吸使电极管内细胞膜破裂,电极胞内液直接相通,而与浴槽液绝缘,这种形式称为“全细胞”记录。它既可记录膜电位又可记录膜电流。其中膜电位可在电流钳情况下记录,或将玻管连到标准高阻微电极放大器上记录。在电压钳条件下记录到的大细胞全细胞电流可达nA级,全细胞钳的串联电阻(玻管和细胞内部之间的电阻)应当补偿。任何流经膜的电流均流经这一电阻,所引起的电压降将使玻管电压不同于细胞内的真正电位。电流愈大,愈需对串联电阻进行补偿。全细胞钳应注意细胞必需合理的小到其电流能被放大器测到的范围(25~50 nA)。减少串联电阻的方法是玻管尖要比单通道记录大。膜片钳技术已成为研究离子通道的"金标准"。美国全细胞膜片钳单细胞
在膜电位改变时,在电场的作用下,重新分布导致通道的关闭,同时有电荷移动,称为门控电流。进口多通道膜片钳价格
膜片钳技术本质上也属于电压钳范畴,两者的区别关键在于:①膜电位固定的方法不同;②电位固定的细胞膜面积不同,进而所研究的离子通道数目不同。电压钳技术主要是通过保持细胞跨膜电位不变,并迅速控制其数值,以观察在不同膜电位条件下膜电流情况。因此只能用来研究整个细胞膜或一大块细胞膜上所有离子通道活动。目前电压钳主要用于巨大细胞的全性能电流的研究,特别在分子克隆的卵母细胞表达电流的鉴定中发挥着其他技术不能替代的作用。该技术的主要缺陷是必须在细胞内插入两个电极,对细胞损伤很大,在小细胞如元,就难以实现,又因细胞形态复杂,很难保持细胞膜各处生物特性的一致。进口多通道膜片钳价格
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