双光子之源：飞秒激光：双光子吸收理论早在1931年就由诺奖得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因为有了激光才得到实验验证，但是到WinfriedDenk发明双光子显微镜又用了将近30年。要理解双光子的技术挑战和飞秒激光发挥的重要作用，首先要了解其中的非线性过程。双光子吸收相当于和频产生非线性过程，这要求极高的电场强度，而电场取决于聚焦光斑大小和激光脉宽。聚焦光斑越小，脉宽越窄，双光子吸收效率越高。对于衍射极限显微镜，聚焦在样品上的光斑大小只和物镜NA和激光波长有关，所以关键变量只剩下激光脉宽。基于以上分析，能够以高重频(100MHz)输出超短脉冲(100fs量级)的飞秒激光器成了双光子显微镜的标准激发光源。这也再次说明双光子显微镜的优势：只有焦平面处才能形成双光子吸收，而焦平面之外由于光强低无法被激发，所以双光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飞秒激光器(100fs脉宽、630nm可见光波长)。虽然染料激光器对于实验室演示尚可，但是使用很不方便所以远未实现商用。很快双光子显微镜的标配光源就变成了飞秒钛宝石激光器。除了固态光源优势，钛宝石激光器还具有较宽的近红外波长调谐范围，而近红外相比可见光穿透更深，对生物样品损伤更小。双光子显微镜明日之星--FemtoFiber ultra 920 。美国激光双光子显微镜荧光探测
美国霍华德·休斯医学研究所在JaneliaFarmResearchCampus的吉娜博士小组与来自中科院上海光机所强场激光物理国家重点实验室的王琛博士较近成功将一种新的自适应光学的方法和双光子显微镜结合，研制出一种新的自适应光学双光子荧光显微镜。通过校正小鼠大脑的像差，在视觉皮层的不同深度处均获得了提高数倍的成像分辨率和信号强度，明显改进了成像质量，使得原来在鼠脑中不可见或者模糊的细节变得清晰可见，她们成功将该方法应用于老鼠视觉皮层第五层（约500µm）的形貌结构成像和钙离子功能成像。这一新的自适应光学方法，使得在小鼠深层区域成像中获得近衍射极限的成像分辨率成为现实。这一成果发表在较新一期的《NatureMethods》。国外激光双光子显微镜厂家电话双光子显微镜中，同样每个时刻只有焦平面上一个点的信号被探测，并且连焦平面外的荧光信号也不会有。
指示剂是如何负载细胞，目前有三种在神经元上填充钙离子指示剂的方法，且都可以用于体内和体外研究。第一种方法是利用玻璃吸管将膜渗透性盐或葡聚糖形式的指示剂注入单个神经元中。此方法方便实验者控制单个神经元内的钙离子指示剂浓度且信噪比较高。第二种是利用“批量加载”的方法将钙离子指示剂染料负载神经元，观察对象为一群神经元。尽管此方法可能导致一些胶质细胞也被指示剂所标记，但明显提高了整体神经元的标记百分比，使研究者得以观察到一群神经元内动作电位相关性的活动。第三种也较为常用，通过病毒转染的方式使其基因编码钙离子指示剂。（A）单细胞注射法；（B）networkloading法；（C）通过病毒转染使其基因编码钙离子指示剂（expressionofgeneticallyencodedcalciumindicators,GECI）
新一代微型化双光子荧光显微镜体积小，重只2.2克，适于佩戴在小动物头部颅窗上，实时记录数十个神经元、上千个神经突触的动态信号。在大型动物上，还可望实现多探头佩戴、多颅窗不同脑区的长时程观测。相比单光子激发，双光子激发具有良好的光学断层、更深的生物组织穿透等优势，其横向分辨率达到0.65μm，成像质量与商品化大型台式双光子荧光显微镜可相媲美，远优于目前领域内主导的、美国脑科学计划重要团队所研发的微型化宽场显微镜。采用双轴对称高速微机电系统转镜扫描技术，成像帧频已达40Hz（256*256像素），同时具备多区域随机扫描和每秒1万线的线扫描能力。此外，采用自主设计可传导920nm飞秒激光的光子晶体光纤，该系统实现了微型双光子显微镜对脑科学领域较广泛应用的指示神经元活动的荧光探针（如GCaMP6）的有效利用。同时采用柔性光纤束进行荧光信号的接收，解决了动物的活动和行为由于荧光传输光缆拖拽而受到干扰的难题。未来，与光遗传学技术的结合，可望在结构与功能成像的同时，精细地操控神经元和神经回路的活动。双光子显微镜已成为较厚有生命体生物组织三维成像中不可或缺的工具。
随着技术的发展，双光子显微镜的性能得到不断地优化，结合它的特点，大致可以分成深和活两个方面的提升。要想让激发激光进入更深的层面，大致可从两个方面入手，装置优化与标本改造。关于装置优化，我们可以把激光束变得更细，使能量更加集中，就能让激光穿透更深。关于标本，其中影响光传播的主要是物质吸收和散射，解决这个问题，我们需要对样本进行透明化处理。一种方法是运用某种物质将标本浸泡，使其中的物质（主要是脂质）被破坏或溶解。另一种方法是运用电泳将脂质电解，让标本的“透明度”提高。这种双光子显微镜的视场是普通显微镜的10倍。国外荧光双光子显微镜作用
双光子显微镜有哪些应用呢？美国激光双光子显微镜荧光探测
光学显微镜和电子显微镜本质的区别在于，光学显微镜：用的是可见光电子显微镜：用的是高频电子射波有什么区别，在于一个基本的原理，光的衍射。。。光波是一个有趣的东西，其中有一项，如果物体的体积小于光的波长，光一般可以绕过去，不发生明显变化。也就是说，有这个物体和没这个物体，在这种情况下，光是不会发生明显改变的。可见光的波长（肉眼）：380～780纳米，也就是，如果比380纳米还要小的东西，用光学显微镜，无论你放大多少倍，也是看不见的。因为光绕过去了。。。光的衍射为了克服这个问题，科学家用波长更短的光去照射物体，也是就被观测物。比如10纳米级的光，这样，就能看到我们用肉眼无论如何都看不见的东西。这就是电子显微镜多说一句，光速是不变的。光速=频率×波长。波长越短，频率越大。。频率越大，光波的能量越大。这就是为什么电子显微镜的功率越大，能看到的东西越小。颜色取决于物体能反射光的波长的长短当你看到的物体小于较小可见光的波长，那它就是没有颜色的。。。因为颜色是肉眼对于可见光频率在大脑中的投影。。。。所以只能把他们统一变为黑白。。。没有颜色不是透明的意思，它们不是肉眼可见颜色的定义中包含的。美国激光双光子显微镜荧光探测
