双光子显微镜的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收2个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有100飞秒，而其周期可以达到80至100兆赫兹。在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜的焦点处的光子密度是比较高的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子显微镜不需要共聚焦，提高了荧光检测效率。双光子显微镜观察到的现象证明了钙离子的增加依赖于肌体触发的钠离子作用电势。ultima2PPLUS双光子显微镜最大分辨率
美国霍华德·休斯医学研究所在JaneliaFarmResearchCampus的吉娜博士小组与来自中科院上海光机所强场激光物理国家重点实验室的王琛博士较近成功将一种新的自适应光学的方法和双光子显微镜结合，研制出一种新的自适应光学双光子荧光显微镜。通过校正小鼠大脑的像差，在视觉皮层的不同深度处均获得了提高数倍的成像分辨率和信号强度，明显改进了成像质量，使得原来在鼠脑中不可见或者模糊的细节变得清晰可见，她们成功将该方法应用于老鼠视觉皮层第五层（约500µm）的形貌结构成像和钙离子功能成像。这一新的自适应光学方法，使得在小鼠深层区域成像中获得近衍射极限的成像分辨率成为现实。这一成果发表在较新一期的《NatureMethods》。激光双光子显微镜价位双光子显微镜成像技术及不同转基因小鼠开展对多种脏器的成像研究。
目前，脑科学的研究在全球范围内如火如荼，中国的脑计划也即将启动。其中，全景式分析脑连接图和功能动态图的研究成为重点研究方向，如何打破尺度壁垒，将微观神经元和突触的信息处理和个体行为信息与全脑融合，是该领域亟待解决的关键挑战。2021年1月6日，由北京大学分子医学研究所牵头，北京大学信息科学与技术学院电子系、工程学院和中国人民医学科学院组成的跨学科团队在NatureMethods上在线发表了一篇题为《大视场、多平面、长程脑成像的微型双光子拷贝》的文章。本文报道了第二代小型化双光子荧光显微镜FHIRM-TPM2.0。其成像视场是团队2017年发布的第1代小型化显微镜的7.8倍。同时具有三维成像能力，获得了小鼠自由运动行为时大脑三维区域数千个神经元清晰稳定的动态功能图像，实现了对同一批次神经元一个月的跟踪记录。
新一代微型化双光子荧光显微镜体积小，重只2.2克，适于佩戴在小动物头部颅窗上，实时记录数十个神经元、上千个神经突触的动态信号。在大型动物上，还可望实现多探头佩戴、多颅窗不同脑区的长时程观测。相比单光子激发，双光子激发具有良好的光学断层、更深的生物组织穿透等优势，其横向分辨率达到0.65μm，成像质量与商品化大型台式双光子荧光显微镜可相媲美，远优于目前领域内主导的、美国脑科学计划重要团队所研发的微型化宽场显微镜。采用双轴对称高速微机电系统转镜扫描技术，成像帧频已达40Hz（256*256像素），同时具备多区域随机扫描和每秒1万线的线扫描能力。此外，采用自主设计可传导920nm飞秒激光的光子晶体光纤，该系统实现了微型双光子显微镜对脑科学领域较广泛应用的指示神经元活动的荧光探针（如GCaMP6）的有效利用。同时采用柔性光纤束进行荧光信号的接收，解决了动物的活动和行为由于荧光传输光缆拖拽而受到干扰的难题。未来，与光遗传学技术的结合，可望在结构与功能成像的同时，精细地操控神经元和神经回路的活动。双光子显微镜能够进行指标成像；
双光子显微镜在各领域研究中已有许多成功实例；生物领域：贝尔实验室的Svoboda等人研究了大脑皮层神经元细胞内钙离子动力学情形。利用双光子显微镜观察到的现象证明了钙离子的增加依赖于肌体触发的钠离子作用电势。信息领域：美国科学家Rentzepis提出了一种在现有二维光盘的基础上将数据储存扩展到三维空间。由于双光子激发具有作用精细体积小的特点，避免了层与层之间的互相干扰，较大地提高了数据储存密度。双光子显微镜已延伸到各个领域研究中，它能对样品进行三维观察，其基础双光子激发效应也具有极高的应用价值。我们可以相信，随着科技不断发展，其他技术的不断结合，双光子显微镜将得到更大的发展与更广的应用。双光子显微镜只有焦平面处才能形成双光子吸收，而焦平面之外由于光强低无法被发动，所以双光子成像更清晰。美国荧光双光子显微镜授权商
双光子显微镜比单光子共聚焦显微镜较大的不同在于无须使用孔限制光学散射。ultima2PPLUS双光子显微镜最大分辨率
临研所、病理科和科研处邀请北京大学王爱民副教授在2020年12月22日做了题目为“新一代微型双光子显微成像系统介绍及其在临床医疗诊断”的学术报告。学术报告由临研所医学实验研究平台潘琳老师主持。王爱民，北京大学信息科学技术学院副教授，毕业于北京大学物理系，获学士、硕士学位，后于英国巴斯大学物理系获博士学位。该研究组研发的微型双光子显微镜，第1次在国际上获得了小鼠大脑神经元和神经突触清晰稳定的动态信号，该成果获得了2017年度“中国光学进展”和“中国科学进展”，并被NatureMethods评为2018年度“年度方法--无限制行为动物成像”。目前，该研究组正在研究新一代双光子显微成像技术在临床诊断中的应用，为未来即时病理、离体组织检测、术中诊断等提供新型的影像手段和分析方法。ultima2PPLUS双光子显微镜最大分辨率
