2PPLUS双光子显微镜分辨率

双光子显微镜的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收 2 个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有 100 飞秒，而其周期可以达到 80至100兆赫兹。在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜的焦点处的光子密度是比较高的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子显微镜不需要共聚焦***，提高了荧光检测效率。这种双光子显微镜的视场是普通显微镜的10倍。2PPLUS双光子显微镜分辨率

首先我们来简单介绍一下激光扫描共聚焦和双光子这两种当红的显微成像技术。激光扫描共聚焦显微技术，是荧光显微成像的一种，用于激发样品的荧光信号并对其放大成像。在激光扫描共聚焦显微镜中，样品焦平面上每一时刻只有一个点被激发光照射，纵然焦平面外也有激发光照射，但通过探测器前的（pinhole），有焦平面上的荧光信号能被探测器接收。也就是说，每个时刻，只有焦平面上一个点的信号被探测。通过点扫描的方式，一个个点的信号就可以组合出终的图像。双光子显微镜（包括多光子显微镜）同样采用点扫描的方式得到图像。不同的是，其采用的激发光波长较长，只有当两个（或更多）激发光光子几乎同时轰击荧光探针的时候才可能激发出荧光信号。所以只有在光子密度特别大的焦点，出才会激发出荧光。也就是说，双光子显微镜中，同样每个时刻只有焦平面上一个点的信号被探测，并且连焦平面外的荧光信号也不会有。国外investigator双光子显微镜成像原理是什么双光子显微镜型号有哪些？

美国霍华德·休斯医学研究所在Janelia Farm ResearchCampus的吉娜博士小组与来自中科院上海光机所强场激光物理国家重点实验室的王琛博士较近成功将一种新的自适应光学的方法和双光子显微镜结合，研制出一种新的自适应光学双光子荧光显微镜。通过校正小鼠大脑的像差，在视觉皮层的不同深度处均获得了提高数倍的成像分辨率和信号强度，明显改进了成像质量，使得原来在鼠脑中不可见或者模糊的细节变得清晰可见，她们成功将该方法应用于老鼠视觉皮层第五层（约500µm）的形貌结构成像和钙离子功能成像。这一新的自适应光学方法，使得在小鼠深层区域成像中获得近衍射极限的成像分辨率成为现实。这一成果发表在较新一期的《Nature Methods》。

要想让激发激光进入更深的层面，大致可从两个方面入手，装置优化与标本改造。关于装置优化，我们可以把激光束变得更细，使能量更加集中，就能让激光穿透更深。关于标本，其中影响光传播的主要是物质吸收和散射，解决这个问题，我们需要对样本进行透明化处理。一种方法是运用某种物质将标本浸泡，使其中的物质（主要是脂质）被破坏或溶解。另一种方法是运用电泳将脂质电解，让标本“透明度”提高。高光子密度带来的高能量容易损伤细胞，所以双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲达到最大值所持续的周期只有十万亿分之一秒，而其频率可以达到80至100兆赫，这样即能达到双光子激发的高光子密度要求，又能不损伤细胞，使扫描能更好地进行。双光子显微镜在各领域研究中已有许多成功实例。

双光子之源：飞秒激光：双光子吸收理论早在1931年就由诺奖得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因为有了激光才得到实验验证，但是到WinfriedDenk发明双光子显微镜又用了将近30年。要理解双光子的技术挑战和飞秒激光发挥的重要作用，首先要了解其中的非线性过程。双光子吸收相当于和频产生非线性过程，这要求极高的电场强度，而电场取决于聚焦光斑大小和激光脉宽。聚焦光斑越小，脉宽越窄，双光子吸收效率越高。对于衍射极限显微镜，聚焦在样品上的光斑大小只和物镜NA和激光波长有关，所以关键变量只剩下激光脉宽。基于以上分析，能够以高重频(100MHz)输出超短脉冲(100fs量级)的飞秒激光器成了双光子显微镜的标准激发光源。这也再次说明双光子显微镜的优势：只有焦平面处才能形成双光子吸收，而焦平面之外由于光强低无法被激发，所以双光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飞秒激光器(100fs脉宽、630nm可见光波长)。虽然染料激光器对于实验室演示尚可，但是使用很不方便所以远未实现商用。很快双光子显微镜的标配光源就变成了飞秒钛宝石激光器。除了固态光源优势，钛宝石激光器还具有较宽的近红外波长调谐范围，而近红外相比可见光穿透更深，对生物样品损伤更小。双光子显微镜使用的是高能量锁模脉冲器。国外双光子显微镜价格

在深度组织中以较长时间对细胞成像，双光子显微镜是当前之选。2PPLUS双光子显微镜分辨率

双光子技术在医疗诊断应用中具有巨大的潜力，该领域还未形成标准和体系，需要系统的医学研究与庞大的医疗数据加以支撑，通过研究人体基于多光子成像技术，进行细胞结构、生化成分、微环境、组织形态、代谢功能的影响信息，找到与疾病的细胞学、分子生物学、组织病理学、诊断和特征的关联关系，共同探究生理病理基础和分子细胞生物学机制，筛选鉴定、皮肤病、自身免疫病及其他疑难疾病的诊断及鉴别诊断依据，建立全新的多光子细胞诊断的完整数据库，定义出针对不同疾病的多光子临床检测设备的产品标准。讨论环节，来自病理科、呼吸中心、心脏科、神经科、皮肤科及研究所的多位医师及研究人员纷纷结合各自的工作领域与王爱民副教授展开了热烈的讨论，其中毛发中心杨顶权主任计划再次邀请王爱民副教授进行学术交流。通过本次学术交流，病理科与研究所分别与王爱民副教授课题组达成了初步合作意向。2PPLUS双光子显微镜分辨率

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