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PCR实验技术中的RT-PCR一步法和两步法的优缺点介绍:一步法:利用同一缓冲液,在同一体系中加入逆转录酶、引物、Taq酶、4种dNTP直接进行mRNA反转录与PCR扩增。发现Taq酶不仅具有DNA多聚酶的作用,而且具有反转录酶活性,可利用其双重作用在同一体系中直接以mRNA为模板进行反转录和其后PCR扩增,从而使mRNA的PCR步骤更为简化。所需样品量减少到比较低限度,临床小样品的检测非常有利。用一步法扩增可检测出总RNA中小于1ng的低丰度mRNA.该法可用于低丰度mRNA的cDNA文库的构建及特异cDNA的克隆,并有可能与Taq酶的测序技术相组合,使得自动反转录、基因扩增与基因转录产物的测序在单管中进行。两步法:由于单管反应时RT和PCR都不能在比较好条件下进行并且容易相互干扰,常只适宜用基因特异引物扩增较短的基因,及定量PCR.两步法则是将RT和PCR分别进行,这样使得两个反应充分发挥各自的特点,更为灵活而且严谨,适合那些GC含量、二级结构严重的模板或者是未知模板,以及多个基因的RT-PCR。英瀚斯生物可承接临床样本、动物组织、细胞样本各类pcr检测。江西高质量pcr

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PCR实验技术中的多重PCR(MultiplexPCR))介绍:多重PCR可实现在同一反应管中同时扩增多个不同的片段。多重PCR不仅意味着节约时间、试剂和样本,同时使得多个扩增子进行同时比较成为可能。当一个反应管中存在多个引物对时,如在多重PCR中,非特异性扩增和扩增效率的降低是较关注的问题,因为反应的优化不可能针对所有的引物对和片段。因此,引物的设计至关重要,以减少错配引起的非特异性扩增。引物序列对于目标片段应该是独特的,且所有引物的Tm值差异应在5℃内。在进行多重PCR前,每个引物对应在单个反应中验证其特异性和扩增效率。而且,不同大小的扩增子应在凝胶电泳中可区分开,以便鉴定。除了引物设计和扩增子大小,热启动DNA聚合酶和特殊优化的PCR缓冲液对于多重PCR也是必需的,它们可有助于扩增的成功率和扩增的特异性。广西推荐pcr技术英瀚斯生物,专业分子检测平台,高质量pcr检测。

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PCR的临床应用主要用于针对疾病遗传病等。PCR在医学检验学中**有价值的应用领域就是对疾病的诊断。理论上,只要样本有一个病原体存在,PCR就可以检测到。一般实验室也能检出10~100基因拷贝,而目前病原体抗原检测方法一般需要105-7个病原体才可检测到。PCR对病原体的检测解决了免疫学检测的“窗口期”问题,可判断疾病是否处于隐性或亚临床状态。定量PCR研究资料已表明,病原体数量与疾病病情的轻重程度、传染性及针对效果均有相关性。许多研究表明,人类免疫缺陷病毒(HIV)后,潜伏期长短和临床症状轻重与血液中的病毒量相关;也有研究表明,HIV病毒载量低于一定值时,没有传染性。在乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒定量研究中发现,病毒的数量与某些药物的疗效相关。例如,干扰素针对对肝炎病毒高拷贝者不敏感,低拷贝者敏感;而有些药物则具有***降低病毒高拷贝的作用。

PCR实验室设计的中心问题是如何避免污染。在实际工作中,常见的有以下几种污染类型:扩增产物的污染;天然基因组DNA的污染;试剂的污染以及标本间的污染。由于一旦发生污染,实验就必须停止,直到找到污染源为止,而且实验结果必须作废,需重新进行实验。所以发生污染后再围绕实验室来寻找污染源不但耗时而且繁琐,浪费人力物力。因此要避免污染,首先应是预防,而不是排除。PCR扩增检验实验室原则上分为四个单独的工作区域:试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区、扩增产物分析区。为避免交叉污染,进入各个工作区域必须严格遵循单一方向进行,即只能从试剂贮存和准备区→标本制备区→扩增反应混合物配制和扩增区→扩增产物分析区。 各实验区之间的试剂及样品传递应通过传递窗进行。靠谱的pcr检测外包公司推荐!

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PCR设计引物应遵循以下原则:①引物长度:15-30bp,常用为20bp左右。②引物扩增跨度:以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。③引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC比较好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3'端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。⑤引物3'端的碱基,特别是较末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。⑥引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列比较好有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处。⑦引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量:每条引物的浓度0.1~1umol或10~100pmol,以比较低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。英瀚斯生物pcr检测,保证真实实验检测,数据保密完整性。江西高质量pcr

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PCR引物设计的原则PCR反应中有两条引物,即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准(常以信息链为基准),5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同;3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。(1)引物设计的基本原则引物长度:15-30bp,常用为20bp左右。引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC比较好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。引物内部不应出现互补序列。两个引物之间不应存在互补序列,尤其是避免3′端的互补重叠。引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%,引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列,否则易导致非特异性扩增。引物3‘端的碱基,特别是较末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,比较好选择是G和C。引物的5′端可以修饰。如附加限制酶位点,引入突变位点,用生物素、荧光物质、地高辛标记,加入其它短序列,包括起始密码子、终止密码子等。江西高质量pcr

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